Vorbereiten:
- Eppis mit Schraubdeckel vorbereiten mit 200 mg große Glasperlen (1,7-2,1 mm Roth A556.1) (4 kl. Löffel) 100 mg kleine Glasperlen (212-300 µm Sigma G1277) (3-4 kl. Löffel), autoklavieren und trocknen
Lösungen:
- 2xCTAB Puffer: 2% CTAB; 1,4 M NaCl; 100 ml Tris-HCL pH 8,0; 20 mM EDTA
- Chloroform : Isoamylalkohol 25:1
- 2-Propanol (= Isopropanol)
- 70 % EtOH (-20°C)
- 1 mg/ml RNASE (Gefrierschrank R 2032)
Durchführung:
- 1,6 ml Algensuspension in die vorbereiteten Eppis (mit Glasperlen) abfüllen, 5 Min. bei 15.000 g zentrifugieren, Überstand verwerfen, Vorgang wiederholen
- 100 µl CTAB-Puffer zum Pellet hinzufügen
- Im BeadBlaster 6 m/s Speed für 16 Zyklen 50 Sek. Mit 5 Sek. Pause bis Algen homogenisiert sind (Die Zerstörung der Zellen unter dem Lichtmikroskop überprüfen)
- 300 µl CTAB-Puffer hinzufügen und vortexen
- Homogenat eine Stunde lang bei 60 °C unter Verwendung des Wärmeblocks inkubieren
- 10 min. bei RT abkühlen lassen
- extrahieren durch Zugabe von 380μL Chloroform:Isoamylalkohol (25:1)
- Suspension 5 Sek. vortexen
- 10 Min. bei 15.000 g zentrifugieren
- Klaren Überstand in ein neues Eppi überführen (Eppi Beschriftung gerde, scharnier oben. Beim Zentrifugieren: Schanier oben, damit das Pellet an der seite ist.)
- 350µl Isopropanol hinzufügen (kann über Nacht bei – 20°C gelagert werden)
- 15 min 4°C 15.000 g zentrifugieren, DNA fällt als kaum sichtbares Pellet aus
- Überstand verwerfen
- Pellet mit 300 µl 70% EtOH (eiskalt) waschen (Achtung Pellet löst sich leicht)
- 2 min 4°C 15.000 g zentrifugieren
- Überstand verwerfen
- Vorgang wiederholen
- Pellet unter der Clean Bench trocknen
- gewonnene DNA in 50 μL TE-Puffer + 1 μL RNAse (1mg/μL) (vorher für alle mischen) auflösen und bei -20°C lagern
Quelle: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352407315000086#f0015
- keine gefährlichen Chemikalien
- keine teuren kommerziellen Kits
- schnell und kosteneffizient
- SDS (sodium dodecyl sulfate) aka. Natriumlaurylsulfat
- 0.5 M NaCl (kein EDTA, Tris–HCl oder pH-Anpassung notwendig)
- Isopropanol (70% (v/v) Ethanol)
- (eigentlich Ausgangsmaterial getrocknete Pflanzenblätter)
- tissulisierte Mikroalgen
kleine Kammer
30 ml |
große Kammer
70 ml |
|
| 27 ml H₂O |
63 ml H₂O |
9 Teile |
| 3 ml TAE (10X) |
7 ml TAE (10X) |
1 Teil |
| 0,3 g Agarose |
0,7 g Agarose |
1% |
-
Zutaten im Erlenmeyerkolben mischen
-
In der Mikrowelle vorsichtig erhitzen, zwischendurch schwenken bis alles gelöst ist. Nicht doll kochen.
-
1x TAE -> 200ml (maximal 2 mal benutzen!)
-
Ladepuffer: • 1.5ml Glycerol • 0.0125g bromophenol blue • 0.0125g xylene cyanol FF
Nur bei GelRed:
- Abkühlen auf 50°C
- dann 1,5µl Farbstoff hinzufügen
bei "Midori Green Direct":
nicht ins Gel sondern 1:10 zu den Proben
-
Gießen (vorsichtig, keine Luftblasen)
-
Erkalten lassen
-
Restlichen 1xTAE Puffer auf das Gel gießen und dann erst Kamm ziehen.
-
Gel laden: 10µl/Tasche
- 3µl von der Ladder + 4µl Wasser + 2µl Ladepuffer + 1µl Midori Green Direct
- 5µl Probe + 2µl Wasser + 2µl Ladepuffer + 1µl Midori Green Direct
-
Bei 75V laufen lassen (40-50 Minuten)
-
Scheibe beschlägt recht schnell#
- abwischen, bevor Fotos gemacht werdn
Mit DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)
Wenn mehrere Ansätze mit dem selben Primerpaar hergestellt werden: Mischung vorher machen um nicht so oft so kleine volumina pipettieren zu müssen.
- 25µl DreamTaq Master Mix (2x)
- 0,5µl Primer F (1µM Konzentration des Primers 100µM)
- 0,5µl Primer R (1µM Konzentration des Primers 100µM)
- 24µl Sample Gesamtmenge: 10 pg - 1 µg
- 12,5µl DreamTaq Master Mix (2x)
- 0,25µl Primer F (1µM Konzentration des Primers 100µM)
- 0,25µl Primer R (1µM Konzentration des Primers 100µM)
- 12µl Sample Gesamtmenge: 10 pg - 1 µg